第十六师团在上海附近登陆时，日军已占领了上海，于是，时任日军华中方面军司令官的松井石根即命令该师团向南京追击从上海撤退的中国军队。
第十六师团在中岛今朝吾的率领下，先后攻占了常熟、苏州、无锡、常州、丹阳、句容、汤水镇、麒麟门，进抵南京东郊的紫金山一线。
该师团沿途烧杀淫掠，其暴行不胜枚举。在向南京进军的途中，该师团由于进军速度太快，补给跟不上，便下令就地征收粮秣，所谓征收，实际上就是掠夺。
当时被日本《东京日日新闻》等报纸大肆宣扬的所谓百人斩就发生在该师团。第十六师团在从无锡向常州追击过程中，该师团第十九旅团步兵第九联队第三大队副官野田毅少尉和大队炮小队长向井敏明少尉，相约在到达南京时，看谁先用日本刀斩杀满100人。此后，两军官开始大肆斩杀，在到达南京城外的紫金山时，野田毅斩杀了105人，而向井敏明斩杀了106人。
对于俘虏，第十六师团师团长中岛今朝吾在其日记中记述说：基本上不实行俘虏政策，决定采取全部彻底消灭的方针
1937年12月10日，日军向南京城发起总攻击，第十六师团的主攻方向为中山门。要占领中山门，必须先占领中山门外的制高点紫金山。
12日，第十六师团步兵第三十三联队在重炮的掩护下，向紫金山顶峰发起攻击，战斗异常激烈，紫金山上一片火海。经过激烈的战斗，日军在付出沉重代价后占领了紫金山主峰。
1937年12月13日凌晨，第十六师团步兵第二十联队占领了中山门。当天，该师团第三十三联队和第三十八联队在轻型装甲车的配合下，从太平门外沿玄武湖急进至南京城北的下关江边，以截断中国军队的退路。
下午，当第三十三、第三十八联队进至下关时，长江边有大批准备渡江的中国军人，江面上也有许多正在渡江的中国军人。日军立即用机枪进行猛烈扫射，一时间江水被染得殷红。
在长江边等待渡江的中国军人有些返回南京城内，避入安全区，有些被日军射杀或俘获。接着，日军在长江边将俘获的中国军人加以集体屠杀。
南京沦陷后，第十六师团根据事先制定好的计划，对南京城内及城外东郊地区进行扫荡。在扫荡过程中，第十六师团俘获了许多放下武器的中国军人。
对于俘虏，中岛今朝吾在其日记中记述说：败逃之敌大部进入第十六师团作战地区的林中或村庄内，另一方面，还有从镇江要塞逃来的，到处都是俘虏，数量之大难以处理。基本上不实行俘虏政策，决定采取全部彻底消灭的方针。仅佐佐木部队就处理掉约15000人，守备太平门的一名中队长处理了约1300人。
在仙鹤门附近集结的约有七八千人。此外，还有人不断地前来投降……处理上述七八千人，需要有一个大壕，但很难找到。预定将其分成一两百人的小队，领到适当的地方加以处理。这些败兵的处理，大多由第十六师团负责，因此师团无暇顾及入城或宿营等，只是一味地东奔西走。
第十六师团步兵第三十旅团长佐佐木到一也在日记中记述说：接连不断地有俘虏前来投降，其数量高达数千人。情绪亢奋的士兵丝毫不理睬上级军官的劝阻，将俘虏一个个地杀死。回想到许多战友流的血和十天来的艰难困苦，别说士兵了，我自己也想说‘全都干掉吧’。
日军占领南京后，以第十六师团步兵第三十旅团为南京警备部队，佐佐木到一担任警备司令。所谓警备，实际上就是搜捕放下武器，在国际安全区避难的中国士兵。